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高光譜熒光成像技術(shù)在活體醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

發(fā)布者: 發(fā)布時(shí)間:2019-12-11

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子成像技術(shù)已經(jīng)與包括遺傳工程模式動物在內(nèi)的動物研究策略有效地結(jié)合在一起。這項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)無損傷的在動物體內(nèi)評價(jià)代表治療效果的分子和細(xì)胞事件,因此可以利用同一組動物進(jìn)行長時(shí)間的研究,從而大大減少了實(shí)驗(yàn)動物的使用數(shù)量。更為有力的是,由于一系列的數(shù)據(jù)來源于同一只或同一組動物,以自身作為內(nèi)對照,大大增加了數(shù)據(jù)的可靠性。

通過活體動物體內(nèi)成像系統(tǒng),可觀測到疾病或癌癥的發(fā)展進(jìn)程以及藥物治療所產(chǎn)生的反應(yīng),并可用于病毒學(xué)研究、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型、siRNA研究、干細(xì)胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細(xì)胞體外檢測等領(lǐng)域。

1 癌癥與抗癌藥物研究

直接快速地觀察各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,并可對癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測和評估?;铙w生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。精諾真生物成像技術(shù)提高了檢測的靈敏度,即使微小的轉(zhuǎn)移灶也能被檢測到(可以檢測到體內(nèi)100個(gè)細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移)。目前已商品化的腫瘤細(xì)胞株包括:前列腺癌,黑色素瘤,乳腺癌,肺癌,子宮頸癌和結(jié)腸癌等BiowareTM細(xì)胞系模型。Rehemtulla等人采用攜帶前體藥物轉(zhuǎn)化酶和酵母胞咯吮脫氨酶基因的腺病毒載體,運(yùn)用活體成像技術(shù)與磁共振成像技術(shù)(magnetic resonance imaging, MRI)研究了其作為轉(zhuǎn)基因治療藥物在癌癥治療中的效果。

2 免疫學(xué)與干細(xì)胞研究

    將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植人脾及骨髓,可用于實(shí)時(shí)觀測動物活體體內(nèi)干細(xì)胞造血過程的早期事件及動力學(xué)變化。有研究表明,應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞,檢測放射及化學(xué)藥物治療的效果,尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制。應(yīng)用可見光活體成像原理標(biāo)記細(xì)胞,建立動物模型,可有效地針對同一組動物進(jìn)行連續(xù)的觀察,節(jié)約動物樣品數(shù),同時(shí)能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原體的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達(dá)的改變。

近年來,不少報(bào)道介紹了應(yīng)用活體成像技術(shù)研究免疫細(xì)胞遷移的實(shí)例。其一是利用人多發(fā)性硬化癥的小鼠模型觀察實(shí)驗(yàn)性自免疫腦脊髓炎中自身抗原反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的遷移模式。包含熒光素酶和GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體處理特定的CD4+T細(xì)胞。首先用流式細(xì)胞儀分選GFP發(fā)光的細(xì)胞,然后分別注人對照及實(shí)驗(yàn)組動物體內(nèi)。熒光素酶在活體的發(fā)光情況表明標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng),而GFP可以進(jìn)一步用于這些細(xì)胞的組織學(xué)定位。雙功能報(bào)告基因的應(yīng)用極大地方便了特定免疫細(xì)胞的篩選及遷移研究。

3 細(xì)胞凋亡

在正常生理?xiàng)l件下,細(xì)胞增殖和凋亡是嚴(yán)格協(xié)調(diào)的,這種平衡一旦打破,就會導(dǎo)致一系列的疾病,包括AIDS、神經(jīng)退行性疾病、脊髓炎綜合癥、缺血/再灌注損傷及腫瘤等等。當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá),產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性,細(xì)胞不能發(fā)光,而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),活化的caspase-3在特異識別位點(diǎn)切割去掉抑制蛋白,恢復(fù)熒光素酶活性,產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象,由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。

4標(biāo)記病毒

  1. 病毒侵染

以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1病毒為例,可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)人神經(jīng)系統(tǒng)的過程。多種病毒已被熒光素酶標(biāo)記,用于觀察病毒對機(jī)體的侵染過程。

  1. 基因治療

基因治療包括在體內(nèi)將一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效地傳遞到靶細(xì)胞。目前,基因治療主要是以病毒做載體,可應(yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因用于載體的構(gòu)建,觀察目的基因是否能夠在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達(dá)。這種非侵人方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及免疫反應(yīng)輕微等優(yōu)點(diǎn)。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中,用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況。

5標(biāo)記細(xì)菌

    利用細(xì)菌熒光素酶基因可以分別標(biāo)記革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。常用的幾十種細(xì)菌都已被標(biāo)記,用來進(jìn)行細(xì)菌侵染和抗生素藥物的研究。

    細(xì)菌侵染研究:可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌侵染活體動物,觀測其在動物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應(yīng)。

抗生素藥物研究:利用標(biāo)記好的細(xì)菌在動物體內(nèi)對藥物的反應(yīng),醫(yī)藥公司和研究機(jī)構(gòu)可用這種成像技術(shù)進(jìn)行藥物篩選和臨床前動物實(shí)驗(yàn)研究。近年來,國際上大型制藥公司紛紛將精諾真技術(shù)在動物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為FDA(美國食品和藥品檢驗(yàn)局)藥物申報(bào)材料中非常重要的臨床前動物實(shí)驗(yàn)部分。

6 基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用

  1. 組織特異性基因表達(dá)

熒光素酶是一類生物發(fā)光酶,其中的Renilla熒光素酶和Firefly熒光素醉分別識別不同的底物。一種細(xì)胞可被這兩種熒光素酶標(biāo)記:Renilla熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動子驅(qū)動,作為內(nèi)參,反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化;Firefly熒光素酶基因由需要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動。這樣Firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化,在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達(dá)活性。

  1. 蛋白質(zhì)相互作用

觀察細(xì)胞中或活體動物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用,是將熒光素酶基因分成兩段,分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA,然后導(dǎo)入細(xì)胞或動物體內(nèi)表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強(qiáng)相互作用時(shí),表達(dá)的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶,在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光,反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑。

  1. 阻斷RNA

通過對比生物發(fā)光的變化,驗(yàn)證在成年小鼠體內(nèi),注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達(dá)。

7 轉(zhuǎn)基因動物模型

    為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá),將熒光素酶基因插人目的基因啟動子的下游,并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動物染色體中,建立轉(zhuǎn)基因動物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光,反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況,從而實(shí)現(xiàn)對目的基因的研究。發(fā)育生物學(xué)方面可用于研究動物發(fā)育過程中特定基因的時(shí)空表達(dá)情況,藥理學(xué)研究方面可觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá),以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。如圖3所示。

研究者根據(jù)研究目的,將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記,同時(shí)轉(zhuǎn)人動物體內(nèi)形成所需的疾病模型,包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等??商峁┌谢蛟隗w內(nèi)的實(shí)時(shí)表達(dá)和對候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng),還可用來評估候選藥物和其它化合物的毒性,為藥物在疾病中的作用機(jī)制及效用提供方法。

8 藥效評價(jià)

對于一些需化學(xué)方法進(jìn)行標(biāo)記的物質(zhì),比如化學(xué)合成藥物、納米藥物及一些肽段等,只能通過化學(xué)合成的方法與熒光染料進(jìn)行偶連,檢測熒光的發(fā)光情況,從而實(shí)現(xiàn)活體示蹤的目的。目前應(yīng)用較多的是對于一些腫瘤靶向藥物在活體內(nèi)靶點(diǎn)的識別、研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及跟蹤化學(xué)藥物在體內(nèi)的分布及代謝情況等。例如用CY5.5及CY7標(biāo)記RGD肽段,研究其在尾靜脈注射不同時(shí)間里對移植膠質(zhì)瘤中細(xì)胞粘附分子Intergrin的特異性識別過程。在腫瘤藥物相關(guān)研究中,用CY5.5標(biāo)記兩種脫氧核糖類似物CY5.5-2DG及CY5.5-NHS均可在小鼠活體水平上直接觀測到其對腫瘤的特異性識別作用。

9 監(jiān)測器官移植

生物發(fā)光成像在器官移植的監(jiān)測方面得到很好的應(yīng)用。其一是監(jiān)測與器官移植密切相關(guān)的基因表達(dá)情況,如肝移植中的血紅素加氧酶;其二是利用熒光素酶的標(biāo)記和示蹤功能來揭示移植反應(yīng)中移植物的動態(tài)表現(xiàn)包括排斥和存活情況等。Chen 等將熒光素酶轉(zhuǎn)基因鼠( FVB/NJ- luc)的胰腺移植至野生FVB/NJ 或異源BALB/c 鏈唑霉素誘導(dǎo)糖尿病鼠體內(nèi),利用生物發(fā)光系統(tǒng)得到的發(fā)光信號來指示體內(nèi)移植物存活情況,并與體內(nèi)血糖水平及移植位點(diǎn)組織學(xué)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,可以得到有價(jià)值的信息。

圖1 不同熒光染料的激發(fā)光譜曲線

圖2A 麻醉裸鼠四種染料試制的分布/ 圖2B 四種染料試制混合注射到裸鼠體內(nèi)觀測試制分布

圖3  注射500 pmol Cy7、Cy7-c(RGDyK)、Cy7-E[c(RGDyK)]2、 or Cy7-E{E[c(RGDyK)]2}2的皮下U87MG腫瘤小鼠在2min、30min、1h、2h、4h、24h時(shí)間內(nèi)的全身NIR熒光成像

圖4(A)注射Cy7-RGD 500pmol的U87MG腫瘤小鼠體內(nèi)NIR熒光成像,實(shí)驗(yàn)組和對照組均注射200μg/小鼠c(RGDyK),箭頭代表腫瘤的位置

(B)在2小時(shí)后無創(chuàng)成像后解剖的U87MG腫瘤和主要器官和組織的代表性熒光圖像。從左到右:U87MG腫瘤,肌肉,肝臟,腎臟和腸

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